ICSI – Victoria in vitro

Avances en la valoración de la calidad ovocitaria.

En diversas entradas del blog hemos tratado el tema de la calidad ovocitaria relacionada con la edad de la mujer, la obesidad, con la endometriosis e incluso, cómo mejorar la calidad ovocitaria. Temas que han suscitado mucho interés entre las pacientes. En esta entrada, nos referiremos básicamente a 3 metodologías, dos de ellas más prometedoras, para valorar la calidad ovocitaria actualmente.

¿Qué se entiende por calidad ovocitaria?

Se denomina calidad o competencia de desarrollo del ovocito a la capacidad que tiene un ovocito para llevar a cabo con éxito la maduración citoplasmática y nuclear, que permite la fecundación y el posterior desarrollo embrionario.

¿Qué influye en la calidad ovocitaria?

Es crucial que el desarrollo de los ovocitos se lleve a cabo en un entorno adecuado en el ovario, durante la foliculogénesis. En ovocitos de buena calidad la maduración nuclear y citoplasmatica, así como el genoma mitocondrial, se han de producir de forma coordinada. Cuando se emplea la estimulación ovárica en los protocolos de reproducción asistida, la selección folicular no es natural por lo que muchos ovocitos obtenidos pueden ser inmaduros, dando lugar a fracaso de fecundación o desarrollo embrionario deficiente que compromete el éxito del proceso.

Por supuesto, en el laboratorio de FIV se han de dar la condiciones óptimas imitando el entorno fisiológico in vivo, de manera que todo ello contribuye al éxito en la fecundación, desarrollo embrionario y gestación.

Por el contrario, una mala calidad ovocitaria puede ser la consecuencia de la edad avanzada en la mujer, dando lugar a una baja funcionalidad mitocondrial y una elevación del estrés oxidativo. Mientras que en mujeres jóvenes puede existir una mala calidad ovocitaria debido a un envejecimiento acelerado del ovario o mutaciones genéticas.

Teniendo en cuenta que el objetivo es el nacimiento de un niño sano, tras la transferencia de un único embrión, la selección de los gametos óptimos es crucial y en el caso concreto que nos ocupa, el óvulo, seleccionar aquel con mayor potencial de éxito es prioritario.

3 métodos para medir la calidad ovocitaria

Tomando como referencia la revisión sistemática de Fisher et al., 2021, vemos tres metodologías más modernas empleadas en la evaluación de la calidad ovocitaria.

Evaluación Morfológica.

La evaluación de la morfología de los ovocitos es un reto que puede servir como una valiosa herramienta para el pronóstico del futuro embrión, su potencial de desarrollo e implantación. Se han utilizado diferentes sistemas de calificación para evaluar ovocitos, embriones tempranos y blastocistos humanos, basándose en determinados parámetros. De hecho, en el blog tenemos varias entradas al respecto siguiendo la clasificación de ASEBIR, que es la empleada en la mayoría de los centros en España y en la que tenido el honor de trabajar durante muchos años. En la Fig. 1 podemos ver los parámetros correspondientes al ovocito.

Sin embargo, a pesar de los parámetros estudiados del óvulo en esta clasificación, e incluso definir las características de un óvulo óptimo, hasta el momento no se incluye al ovocito como parámetro referente en la categorización del embrión.

Hay diversas clasificaciones del ovocito que incluyen otras características como la calidad del huso meiótico, la birrefringencia de la zona pelúcida y el tamaño del folículo.

En el caso del huso meiótico, el estudio emplea la luz polarizada, que permite evaluar la calidad del huso meiótico respecto a su localización, forma y refringencia, clave en la alineación y separación de los cromosomas durante la meiosis (reducción de la carga genética). Se ha observado que ovocitos donde no se aprecia la localización del huso meiótico mediante luz polarizada, tienen una disminución de la tasa de fecundación y formación de blastocistos. No obstante, el equipo necesario para llevarlo a cabo es costoso y requiere un personal con una gran experiencia como para ser considerado en la práctica clínica diaria.

El gran inconveniente de la valoración morfológica es que no es objetiva. A pesar de ser llevada a cabo por embriólogos especializados tras años de entrenamiento, se basa en criterios cualitativos, siendo operador-dependiente, y existen diferencias entre los embriólogos de un mismo centro y entre diferentes centros.

La implementación en los laboratorios de tecnologías más avanzadas como los sistemas time-lapse (STL) y las pruebas genéticas preimplantacionales (PGT) se han centrado en facilitar una selección más objetiva de los embriones, no óvulos, con un mayor potencial de implantación. A pesar de ello, no se ha podido dar una evidencia alta del empleo de estas técnica con el propósito de mejorar las tasas de recién nacido vivo a partir de la transferencia de un único embrión.

Biomarcadores genómicos y proteómicos

La utilización de métodos no invasivos es primordial, por ello se buscan biomarcadores en las células que rodean a los ovocitos, células de la granulosa (COC), y en el líquido folicular (FF).

En las células de la granulosa que rodean al ovocito (COC) se estudia su morfología, compactación y claridad, y la apoptosis (muerte de las células), pero como no parece existir una correlación directa entre la morfología del COC y las tasas de fecundación y desarrollo embrionario, se buscan posibles biomarcadores mediante la genética para detectar determinados genes específicos. Mientras que en el líquido folicular (FF) se analiza la expresión de proteínas, como el factor del crecimiento (IGF; IGFBP-1) y los niveles de zinc.

El problema es que es difícil estandarizar los protocolos o los equipos de los laboratorios. Por otro lado, hay muchas variables que pueden influir en la expresión de dichos genes como las características de cada paciente (edad, peso, causa de su infertilidad, por ejemplo, la endometriosis, síndrome de ovario poliquístico; los tratamientos (estimulación ovárica); laboratorio, etc.

No obstante, se ha propuesto una secuencia temporal o flujo de trabajo, de cómo emplear las distintas técnicas a fin de conseguir la selección de los ovocitos más competentes, antes de realizar la fecundación in vitro, y así, descartar aquellos ovocitos inmaduros, que comprometerían las tasas de fecundación, el desarrollo embrionario a blastocisto, dando lugar a fracasos de implantación. Fig.2

Fig. 2.- Propuesta de flujo de trabajo, basado en la propuesta por Lemseffer et al.,Biomedicines 2022, 10, 2184.

Aunque son necesarios grandes ensayos aleatorios para valorar la utilidad clínica, no se descarta que determinados biomarcadores puedan ser empleados en un futuro. Si bien, es bastante complejo que puedan ser introducidos en la rutina clínica.

Inteligencia Artificial (IA) y Aprendizaje Automático (Machine Learning)

De unos años a esta parte, ha irrumpido en la reproducción asistida la IA, desarrollándose sistemas de clasificación – IA, los algoritmos de IA (conjunto de instrucciones o reglas definidas, ordenadas y finitas que permiten resolver un problema o realizar una tarea específica) pueden analizar imágenes digitales de ovocitos, evaluándolas en función de numerosos parámetros y prediciendo su viabilidad con gran precisión.

La calidad ovocitaria, mediante IA se basa en el análisis morfológico de un elevado número de imágenes donde, a modo de ejemplo, algunos parámetros que se valoran son:

El grado de madurez del ovocito mediante la presencia del 1er corpúsculo polar.
La alineación del ovocito en la realización de la ICSI
La fecundación
La clasificación de la morfología en estado de pronúcleos
La asociación morfológica del ovocitos con el posterior desarrollo de los pronúcleos y desarrollo embrionario.

Dado el gran número de casos de FIV en todo el mundo, permite que la disponibilidad de los datos sea enorme, por lo cual el aprendizaje automático (uno de los algoritmos de IA que permite a las máquinas aprender de los datos y mejorar con el tiempo sin ser explícitamente programadas), avanzará en un tiempo muy breve.

La IA es un tema complejo, por lo que aquí solamente daremos una directrices sencillas respecto a qué objetivos se pretenden alcanzar en la reproducción asistida:

Objetividad
Aumento del éxito de las técnicas aplicadas
Reducir las complicaciones
Una mejor toma de decisiones
Optimizar el tiempo y los recursos
Reducir costos
Obtener una mayor información, precisa y personalizada.

En el caso concreto de la calidad de los ovocitos, los estudios iniciales señalan que se consigue una mayor objetividad y validez a la hora de su selección. Se espera poder estratificar los ovocitos en función de su calidad y emplear sólo aquellos que tengan un mayor potencial de éxito.

Comentarios

Sigue siendo un desafío seleccionar, basado únicamente en la morfología, el embrión único a transferir con el mayor potencial de implantación.

Dentro de los métodos para la selección de los ovocitos en función de su calidad parecen estar centrados en IA y el aprendizaje automático, así como en la genómica dando un mayor conocimiento y valor pronóstico.

Dada la cantidad de datos generados por la FIV, es razonable esperar en un breve periodo de tiempo los algoritmos de las máquinas de aprendizaje automático, mediante el gran número de imágenes, los datos clínicos y de time-lapse, faciliten la valoración de los ovocitos de mayor potencial de éxito.

No obstante, son necesarios más estudios a gran escala, protocolos estandarizados, para conseguir un consenso sobre qué métodos son los óptimos para predecir el éxito de un programa de reproducción.

Victoria

Buscando espermatozoides: la eyaculación retrógrada

En la realización de análisis de semen nos podemos encontrar un bajo volumen de eyaculado (<1,0 ml) que nos debe hacer sospechar que la recolección ha sido incompleta, o que se trate de otras causas como eyaculación retrógrada, ausencia congénita bilateral de los conductos deferentes (CBAVD), hipogonadismo o falta de emisión. Por lo tanto, para diferenciar el origen de esta falta de volumen se debe realizar una prueba rutinaria que consiste en el análisis de la orina post-eyaculación (AOPE) que nos indicará si se trata de una eyaculación retrógrada u otro tipo de alteración.

Centrándonos en el caso de eyaculación retrógrada (ER), ésta viene definida como un trastorno eyaculatorio que resulta en una redirección sustancial del semen durante la eyaculación, desde la uretra posterior a la vejiga y, cuando está presente, puede provocar infertilidad masculina (incidencia 0,3-2%) y en pacientes diagnosticados de azoospermia, la ER se presenta en el 14-18%. La ER puede ser parcial o completa, lo que resulta en un volumen seminal bajo o en la ausencia completa del eyaculado (eyaculado/orgasmo seco). Las causas de la ER son principalmente orgánicas e incluyen anomalías neurogénicas (neuropatía diabética), anatómicas y farmacológicas.

¿En qué consiste el Análisis de la Orina Post-Eyaculación?

La búsqueda de espermatozoides en la orina posteyaculatoria, como ya hemos mencionado, es el principal método para el diagnóstico de la ER, así como una opción de tratamiento para los espermatozoides recuperados para su uso en las técnicas de reproducción asistida (TRA)

Se emplean diversos métodos para la obtención de espermatozoides.

1) Centrifugación y resuspensión de muestras de orina post-eyaculatoria

2) Técnica Hotchkiss (o Hotchkiss modificada)

3) Eyaculación con la vejiga llena.

De forma muy general el proceso AOPE, aquí solo nos referiremos como ejemplo a la centrifugación y resuspensión de muestras de orina post-eyaculatoria, consiste en que una vez obtenida la orina post-eyaculación se distribuye en varios tubos y se centrifugan, aproximadamente 10 minutos a un mínimo de 300 g y el sedimento total, recogido de todo los tubos, tras ser lavado y resuspendido en medio fresco, es evaluado microscópicamente con un aumento de ×400 (Fig.1)

Fig.1.- Pasos en el análisis de orina -posteyaculatorio.

Hay dos aspectos fundamentales a considerar a la hora de realizar el AOPE, la acidez (pH) y la concentración de solutos (osmolaridad) de la muestra de orina, que influyen en la vitalidad y movilidad de los espermatozoides. La muestra de semen fresco tiene un pH promedio de 7,2 a 8,2 y osmolalidad de 300 a 380 mOsm/kg. Si el pH y la osmolalidad son más bajos o más altos que los valores de referencia normales, compromete la supervivencia de los espermatozoides. Como consecuencia el pH y la osmolalidad de las muestras de orina deben estar en el rango óptimo para permitir recoger los espermatozoides vivos y móviles. En el 70% de los casos de ER se suelen recuperar espermatozoides de la orina y su empleo en inseminación artificial ha dado resultado de gestación entre el 25-60%

En pacientes con diagnóstico de aspermia (ausencia de líquido seminal) o azoospermia (ausencia de espermatozoides), se recomienda realizar esta prueba AOPE, porque la identificación de cualquier espermatozoide indicaría una eyaculación retrógrada. Sin embargo, en pacientes con oligozoospermia (bajo número de espermatozoides) de bajo volumen, se deberían observar un “número significativo” de espermatozoides en la AOPE para diagnosticar la eyaculación retrógrada. Si bien, no existe un consenso de expertos sobre qué “número significativo” de espermatozoides deberían observarse al realizar el AOPE.

En líneas generales se define como el límite para el diagnóstico de ER, la observación de 10 a 15 espermatozoides por campo de gran aumento o más de un millón de espermatozoides tras el AOPE.

Uno de mis primeros casos en el campo de la reproducción asistida fue precisamente el de una pareja, donde la mujer era joven y sana, mientras que el varón era diabético desde los 14 años, afectado de eyaculación retrógrada, que diagnosticamos en el laboratorio. Fue necesario ajustar la ingesta de bicarbonato sódico para conseguir un pH y osmolaridad en orina dentro de los rangos de normalidad, así como modificar su dieta. Siguiendo los pasos ya explicados más arriba para AOPE, se consiguió recuperar el número suficiente de espermatozoides para realizar la inseminación artificial, en ciclo con estimulación ovárica, quedando gestante (este trabajo fue presentado en el XVIII Congreso de la Sociedad Española de Fertilidad, Marbella 17-20 de junio, 1987). Llegando a término y nació un bebé sano.

Ciertamente, la aplicación de AOPE se ha ido dejando en desuso, a pesar de ser una técnica segura y no invasiva, porque requiere mucho tiempo y es complejo conseguir que el pH y Osmolaridad en orina. Dado la impaciencia de las parejas cuando llegan buscando una gestación que no consiguen o que el equipo biomédico quiere solucionar sin alterar la rutina de trabajo en el laboratorio, una alternativa perfecta, pero invasiva, es la biopsia testicular.

Si bien, cabe destacar que los pacientes con diabetes de larga duración pueden presentar los conductos deferentes calcificados y las vesículas seminales son incapaces de contraerse, como consecuencia el transporte de los espermatozoide estaría comprometido. Por lo tanto, en estos casos si estaría justificada la recuperación quirúrgica de espermatozoides para tratar los problemas de fertilidad.

Apoyo emocional

Siempre incidimos en la importancia de mantener el equilibrio mental y emocional en el camino de la infertilidad, así que cómo no en este caso concreto de la ER. Se puede lidiar con las emociones, tanto del varón como de lapareja, mediante varias estrategias, como el consejo terapéutico; grupos de apoyo; comunicación honesta con la pareja (sobre miedos, frustraciones) y autocuidado (deporte, yoga, aficiones, etc.). Acudiendo a buenos profesionales.

Consideraciones generales

La ER en principio no requiere tratamiento, ni altera la vida sexual, ni tiene mayor consecuencia, salvo que se quiera tener descendencia. En ese caso el especialista valorará la causa y posible tratamiento.
Es necesario aclarar que no hay medicación que cambie la ER si el origen es debido una cirugía que provocó cambios físicos permanentes en la anatomía.
La ER puede ser reversible en casos de estar tomando ciertos medicamentos para la depresión y los alfabloqueadores, que se utilizan entre otras afecciones, para el tratamiento de la presión arterial alta, hiperplasia prostática benigna (HPB) y algunos problemas de circulación de la sangre. En ese caso puede que el especialista te indique que los deje de tomar mientras intenta dejar embarazada a la pareja.
Por último, hay medicamentos que ayudan a mantener cerrado el músculo del cuello de la vejiga durante la eyaculación, pero pueden tener efectos secundarios y es el especialista el que ha de valorar su empleo.

Si una pareja está en busca de gestación y no lo consigue, la eyaculación retrógrada podría ser la causa del problema si se observa que tras la eyaculación hay muy poco o nada de semen o al orinar, tras la eyaculación, la orina es turbia. Estos indicios son suficientes para acudir a un especialista.

Victoria

Embriones multinucleados. ¿Qué hay de nuevo?

Es importante tener presente el ciclo celular para entender el tema del que tratamos hoy. La regulación del ciclo celular, en lo que se refiere a la mitosis, es un proceso en el que una célula duplica todo su contenido, incluidos sus cromosomas, y se divide para formar dos células hijas idénticas, preservando al mismo tiempo la integridad del genoma. El núcleo no es una estructura permanente durante el proceso, sino que se desmonta cíclicamente para facilitar la segregación cromosómica durante la división celular y luego se vuelve a ensamblar durante la interfase. Fig.1

Fig.1.-El ciclo celular, sus diferentes etapas.

Por lo tanto, durante la transición del cigoto a embrión es un periodo propenso a errores, causando importantes alteraciones en el desarrollo embrionario como retrasos en la división, divisiones tricotómicas y multicotómicas, así como fragmentación celular. Fig. 2

Fig.2.- Delicado paso de cigoto a estadio de 2 células.

Y nos vamos a centrar aquí en un carácter particular como es el de la binucleación y la multinucleación, que consisten en la formación simultánea de dos o más núcleos en una blastómera durante la interfase. De hecho, la multinucleación afecta a una gran proporción de embriones humanos tempranos, generalmente alrededor del día D+2. Se ha estimado su frecuencia, según los distintos autores, oscila entre el 17% y el 69%. Fig. 3

Durante mucho tiempo la valoración de la binucleación (BN) o multinucleación (MN) se ha realizado por criterios de morfología convencional, que consiste en observaciones puntuales a intervalos de tiempo concretos. Así, según los Criterios ASEBIR de valoración morfológica de oocitos, embriones tempranos y blastocistos humanos (criterios de valoración morfológica ASEBIR ) respecto a embriones tempranos, los blastómeros BN o MN observados con frecuencia durante los primeros 2-3 ciclos celulares, penalizaban la valoración del embrión (Categoría D)

Lo ideal es un núcleo por blastómero, que se ha asociado a buenos resultados. Mientras que la presencia de MN se ha considerado un biomarcador de deselección de embriones para la transferencia y la criopreservación embrionaria en los días 2 y 3. Ya que se ha relacionados con alteraciones en la viabilidad embrionaria, tasas reducidas del desarrollo embrionario y porcentajes de implantación más bajos.

Sin embargo, la BN en la etapa de dos células, debido a la falla de la citocinesis puede tener un impacto mínimo en el potencial de desarrollo embrionario y puede ser compatible con la competencia normal del desarrollo. Mientras que la presencia de BN en las etapas de desarrollo preimplantacionales medias y tardías indica errores de segregación cromosómica y aneuploidía posterior en las etapas de blastocisto.

Por ello, los embriones BN tempranos han adquirido una valoración superior a los MN, según los criterios de valoración morfológica ASEBIR. De hecho, fue en la 3ª ed. de los criterios ASEBIR que se publicó que los embriones con un desarrollo óptimo y que presentaban solo una células binucleada en un embrión de 4 células (D+2) o dos células binucleadas en un embrión de 8 células (D+3) pasaron a una categoría C. Fig. 4

Fig.4..- Despenalización de la binucleación

Es interesante observar cómo la introducción de cultivos a día 5 ha permitido que muchos embriones MN se desarrollaran hasta la etapa de blastocisto. Aunque estos blastocistos no se consideran la primera opción para su transferencia, parece que no hay evidencia que sugiera que el hecho de provenir de embriones con MN en las primeras etapas, afecten negativamente las probabilidades de euploidía o resultados positivos en los tratamientos de fertilidad. Esto es un hallazgo alentador, ya que sugiere que, a pesar de las complicaciones iniciales, algunos embriones pueden seguir desarrollándose de manera viable.

Con la entrada de los sistemas de Time-Lapse (STL), ahora podemos obtener imágenes detalladas del desarrollo embrionario, lo que nos permite cuantificar de manera más precisa la cinética celular y los eventos del ciclo celular. Es fascinante que, aunque la MN sea un evento común en la etapa de 2 células, algunos estudios han reportado tasas de nacimiento vivo (LBR) significativas. Además, el hecho de que la tasa de MN sea similar en embriones euploides y no euploides en esa etapa sugiere que la MN podría no ser un indicador definitivo de la viabilidad del embrión. Las valoraciones morfológicos y morfocinéticos, son biomarcadores no invasivos, que ayudan en la selección y / o deselección de embriones para la transferencia y criopreservación. Si, además, se añade el disponer de un método invasivo como el cribado genético preimplantacional para la aneuploidía (PGT-A), se amplían las posibilidades de emplear blastocistos procedentes de embriones MN que den lugar al nacimiento de niños sanos.

¿Cuál es el posible origen de los MN?

Según el reciente trabajo de Coticchio et al., 2024 mediante estas técnicas avanzadas, STL y PGT-A, se ha podido conocer que la MN puede ser causada por al menos tres mecanismos diferentes:

-Alteración importante del huso mitótico.

– Fusión de blastómeros.

– Fallo en la división de blastómeros.

Aproximadamente el 40% de los embriones en etapa de división temprana (dos o cuatro células) pueden verse afectados, lo que sugiere que la MN puede ser un fenómeno reversible. En las transferencias de embriones tempranos monitoreados que presentan MN, se asocia con una morfología embrionaria más pobre, anomalías en la división, retraso en el desarrollo embrionario, bajas tasa de implantación y de recién nacido vivo.

No obstante, considerando que un porcentaje de embriones MN nada despreciable pueden desarrollarse hasta blastocistos y no hay una evidencia consistente de que las probabilidades de euploidía o la capacidad de implantación de los blastocistos con antecedentes de MN estén afectadas, se recomienda el cultivo extendido como una estrategia clave del laboratorio.

Según los autores, en referencia a la BN en la etapa de dos células puede reflejar mecanismos mitóticos únicos del cigoto basados en la segregación de doble huso y ser compatible con la diploidía y el potencial de desarrollo normal.

Por otro lado, se ha asociado el aumento de MN con la edad de la paciente, y ambos parámetros parecen ser predictores significativos de embarazo clínico.

Es de resaltar que:

La MN de embriones humanos sigue siendo un fenómeno no completamente comprendido, pero relevante e intrigante desde el punto de vista del desarrollo embrionario, que requiere más investigación de sus mecanismos generativos e implicaciones clínicas.

Si bien, la evidencia sobre embriones monitoreados y transferidos en las etapas de división indica que la MN se asocia con una reducción de la calidad morfológica del embrión, las tasas de división, porcentaje de implantación y de recién nacidos vivos, el cultivo a día 5, la monitorización por STL y diagnóstico genético PGT-A, permiten disponer de un plus de embriones para transferir.

Victoria

Riesgos de la edad paterna avanzada

La presión social sobre la mujer respecto a la edad para concebir y las consecuencias de una edad materna avanzada (EMA) es implacable, lo hemos tratado en el blog en varias entradas analizando la edad y alteración de la calidad ovocitaria y como la edad para ser madre, si importa.

Mientras que esta presión sobre el reloj biológico para los hombres prácticamente no existe. El hecho de que el hombre tenga espermatozoides toda su vida, le permite ser padre a cualquier edad, pero ¿la calidad de los espermatozoides es la misma con 25 que con 65 años?

Antes de avanzar en este tema, recordemos que:

Un hombre comienza a producir espermatozoides durante la pubertad y continúa produciendo espermatozoides durante el resto de su vida.
Las señales de la glándula pituitaria en el hipotálamo inducen a los testículos para que produzcan testosterona, fabriquen y almacenen espermatozoides y produzcan líquido seminal.
Los órganos que constituyen el tracto reproductor masculino (testículos, epidídimo, vesículas seminales, glándula prostática) deben funcionar con la máxima eficiencia para preparar, transportar y eyacular los espermatozoides durante el coito.
Para que la fecundación se lleve a cabo, se requiere un número elevado de espermatozoides, con buena movilidad y morfología, de manera que las probabilidades de que uno de ellos consiga fecundar el óvulo se vean favorecidas. Además, el material genético de ese espermatozoide, su ADN, ha de estar cromosómicamente intacto para producir un bebé sano.

¿Qué ocurre con la edad paterna avanzada (EPA)?

Aunque no existe una única definición aceptada de edad avanzada de un hombre, desde el punto de vista reproductivo, cada vez hay más trabajos que sugieren que la edad paterna avanzada (EPA) se puede considerar conforme supera los 40 años, contribuyendo a una mayor vulnerabilidad en su descendencia a las enfermedades hereditarias.

En el hombre, entre los 40 -50 años, se produce la andropausia cuya señal más reconocible es la disminución de los niveles de testosterona, debido por un lado a que las células encargadas de producir testosterona en los testículos (células de Leydig) disminuyen su producción y, por otro lado, aumentan los niveles de una globulina fijadora de las hormonas sexuales (SHBG, por sus siglas en inglés). La SHBG es una proteína producida por el hígado que se une a las hormonas sexuales en el torrente sanguíneo, incluyendo la testosterona y los estrógenos. Su importancia radica en que la SHBG actúa como un amortiguador, controlando la cantidad de hormonas sexuales disponibles para el cuerpo, de manera que mantiene un delicado equilibrio en los procesos donde intervienen las hormonas sexuales. Así, al aumentar la edad del varón, los niveles de SHBG aumentan y esto supone una disminución de la testosterona libre en el torrente sanguíneo. Los cambios en el aparato reproductor masculino por el envejecimiento se van a ir manifestando tanto en el tejido testicular, como la producción de espermatozoides (calidad y cantidad) y en un aumento de la disfunción eréctil, los cuales van a comprometer la fertilidad masculina. Es de subrayar que todos estos cambios usualmente ocurren de manera gradual y no es igual para todos los hombres.

En lo que respecta a la calidad seminal, al ir avanzando la edad por encima de los 35 años, el volumen seminal va a disminuir, así como la concentración de espermatozoides, la movilidad, porcentaje de formas normales y el ADN espermático se puede ver alterado por diversas condiciones endógenas y exógenas. De hecho, los últimos estudios indican una mayor rotura de las cadenas de ADN alrededor de los 40 años. Por lo cual algunos autores sugieren la incorporación de valoración de la fragmentación del ADN de rutina en el estudio de fertilidad del varón con edad avanzada. Todo ello, lleva a la necesidad de informar especialmente a los varones infértiles que pretenden retrasar su paternidad.

En la concepción natural varones con EPA tienen menores tasas de fecundación y mayores tasas de aborto

Cuando se recurre a las técnicas de reproducción humana asistida (TRAs), los resultados, relacionados con una EPA, se reflejan en:

Menor tasa de fecundación
Menor calidad embrionaria
Menor tasa de implantación
Menor tasa de gestación
Menor porcentaje de recién nacido vivo

Si bien es cierto que existe cierta confusión entre los diversos trabajos, dado que aquellos que no han tenido en cuenta los óvulos de mujeres de edad materna avanzada o los óvulos de mujeres jóvenes, propios o donados, pueden subestimar la influencia de la EPA. Es evidente que la combinación de una edad avanzada paterna (EPA) y materna (EMA) es la que tiene una menor probabilidad de resultados positivos en TRAs.

Riesgos en la descendencia asociados a varones de edad avanzada.

Con el aumento de la edad, como hemos mencionado anteriormente, la calidad seminal va a ir disminuyendo y va a comprometer la posibilidad de conseguir un embarazo. Esto puede ser debido a que los espermatozoides no pueden llegar al tracto genital femenino (disfunción eréctil) o que, al disminuir la calidad espermática, se van reduciendo las posibilidades de que un espermatozoide pueda llegar a fecundar al óvulo, debido a anomalías en su material genético (mutaciones del ADN, aneuploidías cromosómicas, modificaciones epigenéticas como el silenciamiento de genes esenciales)

Se ha estimado que la incidencia de mutaciones autosómicas dominantes de novo, en la descendencia de padres de 40 años o más es de menos del 0,5%. Si bien pudiera estimarse como un riesgo bajo, lo cierto es que estas patologías están asociadas a un fenotipo grave, por esta razón algunos autores sugieren que se debería incorporar en el asesoramiento genético prenatal este riesgo para los embarazos con EPA.

Por otro lado, el aumento de la edad paterna parece estar asociada a alteraciones psicológicas y cognitivas en la descendencia, con un aumento de conductas alteradas en la infancia como, por ejemplo, respuestas emocionales hostiles e inestables o impulsividad; un menor coeficiente intelectual y un mayor riesgo de autismo, esquizofrenia y trastorno bipolar.

A fin de poder controlar los riesgos se ha propuesto que en los casos de EPA se incorpore información de aquellas parejas con varones de edad avanzada.

Asesoramiento preconcepcional:

Señalar los riesgos de infertilidad y aborto espontáneo.
La posibilidad de mutaciones de novo
Mutaciones autosómicas dominantes de novo (trastornos por efecto de la EPA)

Asesoramiento concepcional:

Explicar las limitaciones de realizar sólo el cariotipo.
La necesidad de realizar pruebas genéticas más complejas.
Se está investigando en la secuenciación del exoma completo (WES), pero es una técnica cara, compleja y es necesario profundizar en su beneficio/ riesgo/ limitación de la técnica.
Análisis del ADN de células libres en suero materno. Se están desarrollado paneles de hasta 30 afecciones genéticas, pero queda pendiente valorar su rendimiento en la rutina clínica.

En resumen:

La EPA contribuye a una mayor vulnerabilidad en su descendencia a las enfermedades hereditarias. Aunque su impacto parece ser pequeño, pero significativo.

A partir de los 40 años los hombres experimentan una serie de cambios que comprometen su fertilidad, usualmente ocurren de manera gradual y no es igual para todos ellos.

Es importante la valoración de la fragmentación del ADN espermático de rutina en el estudio de fertilidad del hombre con edad avanzada (EPA). Es necesario informar especialmente a los varones infértiles que pretenden retrasar su paternidad.

Se debería incorporar el asesoramiento genético pre- y concepcional sobre el riesgo de los embarazos obtenidos de hombres con EPA.

Victoria

Directos Instagram, ahora en el blog

Queridos amigos:

Quiero comentaros que hemos abierto una nueva área, los directos realizados en Instagram @victoriainvitro, de manera que si no los habéis visto lo podréis hacer desde el blog.

En los directos Instagram, hemos tenido la fortuna de contar con grandes profesionales donde se han tratado temas que, en su mayoría, previamente se han desarrollado en blog. El objetivo de estos directos, es ampliar con profesionales que se encuentran en primera línea de trabajo, la información disponible y, resolver aquellas dudas que suelen preocupar a las personas que recurren a las técnicas de reproducción asistida.

Quiero expresar mi admiración y gratitud hacia los profesionales que han contribuido tan generosamente a este proyecto.

Aquí os dejo el link Directos de Instagram – Victoria in vitro

Espero que os resulten muy interesantes los temas abordados y, como siempre, no dudéis en preguntar o proponer temas para desarrollar.

Os leo con atención.

Victoria

Avances en Diagnóstico de Infertilidad Masculina: Tecnologías y Metodologías

Durante mucho tiempo, de cara a la opinión pública, el estudio del varón infértil se limitaba a una valoración del seminograma básico y un perfil hormonal. Cuando la muestra seminal presentaba unos valores por debajo de los límites considerados rangos de normalidad, parecía que todo estuviese perdido o con muy bajos resultados.

El estudio de las causas de la infertilidad masculina, se han ido desarrollando diversas estrategias a nivel pre-testicular, testicular y post-testicular, como ya tratamos en una entrada del blog anterior, Fig. 2-3.

Fig. 1.- Causas de infertilidad masculina pre-testiculares y testiculares

Fig. 2.- Causas de infertilidad masculina post-testiculares

La incorporación de la ICSI, abrió un campo de posibilidades a aquellos varones que no podían tener descendencia. No obstante, y como ya hemos tratado anteriormente, la ICSI ha de aplicarse en los casos que lo requieran y no se aconseja su utilización de forma general.

Conforme avanzan la tecnología y los conocimientos, queda al descubierto una gran área por investigar en el diagnóstico de la infertilidad masculina y la selección espermática. Recodemos que los mejores espermatozoides seleccionados han de pasar a través del tracto genital femenino por el útero, oviducto, el istmo y en la ampolla donde llegarán para fecundar un óvulo, pero para ello han de completar diferentes etapas que han sido objeto de numerosos estudios.

Etapas de los espermaozoides en la fecundación del óvulo

La capacitación espermática, es un conjunto de cambios fisiológicos durante la maduración de los espermatozoides, permitiéndoles fecundar un óvulo. Destacando patrones alterados de movilidad (movilidad hiperactivada) y una remodelación sustancial de la membrana plasmática para facilitar la presentación/desenmascaramiento de los receptores de la superficie de los espermatozoides que dirigen la adhesión y la penetración de la matriz del cúmulo, test de la unión al ácido hialurónico (AH).

Especial importancia tienen los biomarcadores, por ejemplo, el lípido monosialotetrahexosilgangliósido (GM1), se emplea como biomarcador para valorar la porcentual de espermatozoides capacitados mediante el test comercial llamado Cap-Score, que en función de la valoración de la distribución espacial del gangliósido espermático dominante GM1, permite diferenciar entre varones fértiles e infértiles.

Reacción acrosómica conduce a la liberación de su contenido acrosómico, una serie de enzimas que debilitan la capa pelúcida del óvulo y, por otro lado, se produce una remodelación de la estructura de la cabeza del espermatozoide permitiendo la fusión de las respectivas membranas de los gametos y la fecundación.

Además de la contribución del genoma paterno, hay pruebas de que los espermatozoides transmiten factores epigenéticos, incluidos los sncRNAs, son pequeñas cadenas de RNA (Ribonucleic acid, RNA) que no se traducen en proteínas, y van a influir en:

Regulación epigenética
Maduración del esperma
Desarrollo embrionario
Efectos intergeneracionales

Es decir, los sncRNAs, intervienen en el proceso de la embriogénesis preimplantacional. Fig. 3

Metodologías desarrolladas en busca del espermatozoide más competente

Basados en los estudios sobre la fisiología de los espermatozoides se han ido desarrollando diversas metodologías a fin de detectar el espermatozoide más competente para conseguir la fecundación. En la Fig. 5a, podemos ver metodologías más convencionales y más innovadoras, muchas de ellas se emplean en la práctica clínica. Y en la Fig. 5b hacia donde se dirigen los estudios futuros sobre la infertilidad masculina, partiendo de técnicas ya empleadas en los laboratorios, surgen nuevas tecnologías. Además, los algoritmos de la inteligencia artificial (IA) aportan una mayor información objetiva, reducen el tiempo de trabajo y procesan gran cantidad de datos.

Fig. 5a.- Metodologías establecidas e innovadoras

Es de esperar que la tendencia hacia una medicina de precisión permita el manejo de la infertilidad masculina de forma más detallada gracias a las plataformas tecnológicas avanzadas (secuenciación del exoma completo) y los análisis proteómicos (identificación de biomarcadores moleculares). Así como la asociación de tecnología de imágenes avanzada (imágenes holográficas de esperma en 3D) y la IA, cuyos algoritmos podrán seguir mejorando a medida que se disponga de grandes y robustos conjuntos de datos para su entrenamiento, aprendizaje automático.

Comentario

En esta breve exposición se ha tratado de mostrar como es el avance dentro del estudio andrológico de la infertilidad masculina, centrado en la selección espermática, y hacia dónde se encamina. Mucho más allá, usando como pilares técnicas microfluídicas, la robótica o automatización de los procesos y la inteligencia artificial, para la próxima década se espera que muchos de los procesos del laboratorio de FIV se realicen de forma mucho más objetiva y automatizada, ya se habla del “laboratorio de FIV en una caja”, pero esto es otro tema y se escapa a esta entrada.

No obstante, muchas de las metodologías expuestas tienen un desarrollo preclínico y necesitan ser validadas antes de entrar a formar parte de la rutina clínica. Puede que algunas a pesar de ser interesantes desde el punto de vista de la investigación, no se encuentren dentro de un rango satisfactorio de coste/beneficio.

Se abre una nueva etapa con mayor conocimiento y tecnología avanzada que resulta excitante y prometedora, esperemos que no solo faciliten el trabajo en los laboratorios de FIV, sino que permitan hacer realidad el sueño de muchas personas.

Victoria

Importancia de la primera división mitótica, de cigoto a embrión temprano

Hemos tratado en el blog el seguimiento del desarrollo embrionario desde la fecundación hasta blastocisto en diferentes entradas. Incluyendo dentro del dentro del día +1 (D+1) la división temprana (DT), observación adicional 25-27h posinseminación. Si bien en un principio se podría pensar que DT sería un «plus de calidad», es controvertida la relación entre la DT y los resultados clínicos, en cuanto a tasas de implantación y gestación.

De hecho, no parece ser una variable morfocinética de gran peso específico para el pronóstico de la implantación. Únicamente, si en el momento de la valoración de la DT mediante la observación por los sistemas de Time-lapse (TLS), el embrión presenta 3 blastómeros, procedentes de una división rápida o directa (de 1 a 3 células) tiene su importancia. Este fenómeno también se ha denominado mitosis tricotómica, mitosis tripolar o multipolar, división directa o división anormal y se define como la división abrupta de un blastómero en tres blastómeros hijos o un intervalo de ciclos celulares inferior a cinco horas. Si ocurre principalmente en la primera división mitótica, así como en la segunda y tercera división, van a dar lugar a embriones que tienen comprometido su potencial de implantación y en consecuencia un mal pronóstico reproductivo.

En esta entrada nos vamos a centrar en la primera división mitótica anormal, de una a tres células.

Primera división mitótica

Una vez producida la singamia (fusión de los dos gametos haploides, el espermatozoide y el óvulo) tienen lugar una serie de eventos mitóticos que consisten en duplicar el número de células (blastómeros) después de cada ciclo celular (10-12h). Es de una gran relevancia este paso, ya que a partir de una célula (cigoto) se producirá todo un ser completo. Una vez el cigoto se divide en dos células hijas indiferenciadas (blastómeros), es de esperar que ambas reciban la misma cantidad de material nuclear (mitosis) y citoplasmático (citocinesis), o sea, que sean iguales, y esto transcurre bajo el control de factores maternos primarios almacenados del ovocito Figura 1.

Fig.1.- Desarrollo de fecundación a primera división

Sin embargo, puede ocurrir que la primera división mitótica esté alterada dando lugar a una distribución desigual del material genético en los blastómeros. De hecho, la primera división mitótica es la principal fuente de aneuploidías de origen mitótico en embriones humanos. Es excepcionalmente propensa a errores dando lugar a una pérdida de cromosomas, la principal responsable del mosaicismo preimplantacional, y parada del desarrollo celular.

En el embrión preimplantacional temprano con un número incorrecto de copias cromosómicas es un factor crítico, ya que ocasiona fallos de implantación, pérdida temprana del embarazo o embarazos en curso cromosómicamente anormales.

El trabajo de Coticchio et al., 2023 lo considero muy didáctico para explicar la importancia del paso de singamia, mediante la primera división mitótica, a las dos células hijas y los diferentes fenómenos adversos que se producen en este periodo, al referirlos como un puente de suelo de tablas y cada una de ellas si se altera tendrá graves consecuencias en el desarrollo del futuro embrión. Fig. 2

Fi.2.- Mediante este esquema se representan las diversas adversidades que pueden ocurrir en el transcurso de paso de cigoto a dos células hijas (blastómeros) marcano el posterior desarrollo embriionario.

Uno de estos fenómenos adversos es la división tricotómica o división directa desigual de una célula a tres, también pueden producirse cuatro o cinco blastómeros, pero es menos frecuente. Como ya hemos mencionado, se trata de un ciclo celular más corto (5h) que no permite la replicación completa del ADN y por lo tanto habrá una distribución desigual del ADN entre ambos blastocistos.

Una de las explicaciones de la división mitótica anormal, dentro de la complejidad de los pasos implicados en la mitosis (que se escapan a esta entrada), está relacionada con el huso mitótico o acromático. Se trata de una estructura crucial en la división celular, formada por microtúbulos proteicos que se desarrolla durante la mitosis y la meiosis. Su función principal es asegurar la correcta segregación de los cromosomas en las células hijas.

En condiciones normales, los microtúbulos del huso se organizan en dos polos opuestos. Esto permite que los cromosomas se distribuyan adecuadamente entre las células hijas.

Cuando se observan tres células hijas en lugar de dos, es probable que el huso mitótico haya sufrido una modificación anormal. Esto resulta en la formación de tres polos de microtúbulos durante la mitosis. Como consecuencia, se producen errores en la distribución de los cromosomas.

En la Fig. 3 el esquema se compara la segregación cromosómica tomando como representación de los 46 cromosomas un par de cromosomas metacéntricos y un par de cromosomas acrocéntricos. Se representan los pares paternos (amarillos) y maternos (verdes) de cromátidas, respectivamente; centrómero, puntos grises; microtúbulos del huso, líneas azules y centrosomas (cilindros azul ).

(a) Huso bipolar normal, segregación cromosómica en un huso bipolar, ambas células hijas tienen los dos pares normales de cromosomas.

(b) Huso tripolar, la mitosis tripolar conlleva una distribución aleatorio de cromosomas a uno de los tres ejes, dos de cada tres hijas. De manera que dos células tienen solo 3 cromosomas y son monosómicas para el cromosoma acrocéntrico y la tercera célula es nulisómica para el cromosoma metacéntrico y tiene un par biparental normal para el cromosoma acrocéntrico.

Fig.3 La mitosis bipolar con reparto igualitario de material genómico y citoplasmático en las células hijas (blastómeros) y Mitosis tripolar, donde los cromosomas se reparte de forma aleatoria dando lugar a nulisomias, momosomias y diversas alteraciones cromosómicas

En resumen, las células hijas recibirán un material genético anormal, ya sea en exceso o en defecto. Esto puede afectar su viabilidad celular debido a inestabilidades cromosómicas o mutaciones en los genes relacionados con la división celular.

Mediante la realización de test genético preimplantacional para aneuploidías (PGT-A) se han relacionado ciertas formas complejas de aneuploidía embrionaria caótica (una o más disomías, monosomía paterna y materna, entre otras) con una segregación cromosómica inicial dirigida por un huso tripolar.

¿Qué datos hay sobre la primera división mitótica directa?

Uno de los primeros trabajos más completos sobre las divisiones directas en primera, segunda y tercera división es el de Zhan et al., 2016, datos que se resumen en el siguiente esquema, junto a aportaciones de otros autores. Fig.4

Fig.4 Datos sobre la primera división mitótca directa

¿Qué hacer con los embriones derivados de una división tricotómica?

Los sistemas de Time-Lapse has marcado un antes y un después en la selección embrionaria, especialmente para deseleccionar aquellos embriones que a priori morfológicamente parecen “perfectos” pero, al observar su evolución, se detectan anormalidades de desarrollo. Uno de los primero pasos donde se producen dicha anomalías es en la primera división mitótica. Cuando se produce una primera división mitótica directa desigual, los embriones derivados de este tipo de división están asociados a embriones multinucleados, tienen una baja tasa de desarrollo a blastocisto, y de hacerlo, los blastocistos euploides transferidos parecen tener muy poca o ninguna capacidad de implantación. Es más, en estudios donde se ha analizado la segunda división mitótica directa de 2 a 3 células, se sugiere que los embriones con este tipo de división directa deberían ser descartados, es más, sugieren esta característica como posible marcador morfocinético potente válido en el uso clínico.

Comentario

Se están realizado diversos estudios sobre la implicación de la primera división mitótica anormal facilitando un mayor conocimiento sobre la causa del desarrollo embrionario anormal, su bloqueo o su incapacidad para implantar. De manera que, desde el estadio de singamia se pueda realizar una valoración con carácter predictivo sobre el posible desarrollo embrionario y, por tanto, tomar medidas que permitan realizar algún tipo de acción o descartarlos para evitar transferencias ineficaces.

Espero que el tema haya sido de tu interés .

Si tienes alguna sugerencia o pregunta házmela saber.

Victoria

Traslado de muestras criopreservadas. A petición del paciente.

Todos los embriones generados mediante las técnicas de reproducción asistida (FIV) han de tener un proyecto reproductivo, por lo tanto, los pacientes, mujer sola o pareja, son responsables del destino de sus embriones criopreservados. Si por diversas causas deben trasladarlos, es importante que conozcan que se puede pedir el cambio de centro de custodia y de qué forma llevarlo a cabo. Este tema que generaba cierta incertidumbre a los pacientes y profesionales hace unos cuantos años, nos llevó a publicar en 2012, un artículo centrado en el traslado de los embriones criopreservados entre los centros de reproducción humana (RHA) cuyo objetivo era determinar cómo abordar el tema de los traslados de embriones criopreservados, ya que no existía un protocolo único para todos los centros (Grossmann et al., 2012)

Recientemente se ha publicado la Guía de traslados de muestras Criopreservadas, realizada por el Grupo de Interés de Criobiología de ASEBIR (GIC-ASEBIR). Desde aquí, felicitarles porque era algo necesario que se había dilatado en el tiempo.

La elaboración de esta Guía del GIC-ASEBIR, no sólo se refiere a embriones, sino que bajo el término muestras criopreservadas se incluye:

Embriones humanos procedentes de técnicas de reproducción asistida, embriones tempranos, mórula o blastocisto hasta el séptimo día tras la aplicación de la técnica correspondiente.
Óvulos obtenidos tras ciclos de estimulación.
Muestras seminales.

Los autores han hecho un gran trabajo, ratificado por la Junta Directiva de ASEBIR, al recoger la legislación vigente (revisada por Fernando Abellán García, Derecho Sanitario); definir los diferentes tipos de traslado y documentación necesaria; cómo han de ser los contenedores, el transporte, etiquetado de muestras y documentación que ha de acompañarlos; la trazabilidad y los traslados internacionales. Siempre cumpliendo la Ley de Protección de Datos Personales y Garantía d ellos Derechos Personales (LOPD), a cargo del centro origen que ha de proteger la información personal de los pacientes durante el traslado siempre que lo realice un tercero.

De los tres tipos de traslados de material criopreservado:

Traslados a petición puntual del paciente.
Distribución de gametos o embriones donados
Traslados de muestras por causa de fuerza mayor

Nos vamos a centrar en esta entrada en el primer punto, referido al traslado a petición del paciente, a grandes rasgos, por considerar que puede generar más interés para ellos.

¿Por qué cambiar de centro donde está el material criopreservado?

Los motivos por los cuales los pacientes requieren trasladar sus gametos/embriones a otro centro suelen ser:

Cambio de domicilio de una ciudad a otra e incluso a otro país.
Descontento con la clínica que generó los embriones.
Cambio de la Seguridad Social a una clínica privada.
Preferencia de atención en otro centro.

¿Qué pasos son necesarios para realizar el traslado a petición de los pacientes?

Los pasos a realizar están bien definidos según el tipo de traslado, en los que respecta a para gametos y embriones es el mismo:

Los pacientes deben notificar por escrito al centro donde tienen su material criopreservado (centro origen/ centro emisor), su deseo de trasladarlo a otro centro (centro receptor) mediante una solicitud de traslado.
Firmar el documento donde se acuerda el traslado.
El centro receptor, ha de ser un centro autorizado por las autoridades sanitarias correspondientes, emitirá un documento de aceptación de la muestras.
Preparación de las muestras, etiquetado, almacenamiento y documentación que la acompaña. Todas las muestras biológicas criopreservadas se encuentran almacenadas a una temperatura de –196ºC sumergidas en nitrógeno líquido. Se encuentran bien identificadas ya que deben incorporar en la superficie del dispositivo de soporte (criotubo, pajuela, cryotop, cryolock, etcétera) la información básica de identificación: Nombre y apellidos del/la propietario/a de la muestra biológica; tipo y número de muestras que contiene; fecha de congelación y número de dispositivo.

Una vez localizadas las muestras, se pasan a los contenedores de transporte, embalaje secundario, son pequeñas bombonas de nitrógeno líquido o de vapores de nitrógeno líquido mediante los transportes en seco o dry-shippers. Los dry-shippers son criotanques que están recubiertos internamente por un material poroso que absorbe el nitrógeno líquido y mantiene la temperatura estable a través de los vapores que emanan internamente durante todo el proceso. Es el sistema más recomendable, mantiene una autonomía de unos 7-8 días, semejante a los contenedores de nitrógeno líquido. Además, los dry-shippers son los únicos autorizados para realizar los traslados vía aérea o por ferrocarril, por no contener líquido potencialmente peligroso.

Es imprescindible contar con un dispositivo adosado al criotanque con una sonda de temperatura en su interior, data logger. Este tipo de dispositivos permiten una monitorización continua de temperatura, permitiendo la trazabilidad del proceso.
Una vez las muestras en el interior del criotanque, se cierra y sella con una brida numerada de forma correlativa.
La documentación para el centro receptor consta de la siguiente información: Centro origen; fecha de congelación; tipo y características (semen, ovocitos, embriones); procedimiento detallado de criopreservación y recomendaciones para su descongelación. Por último, información relevante donantes/pacientes, origen de los gametos

Este documento se adjunta junto al criotanque sellado, dentro de la estructura de protección, embalaje exterior, que se sella con una nueva brida numerada. De esta manera, se asegura que el criotanque no ha sido manipulado en ningún momento durante todo el trayecto. Normalmente se añaden un par de bridas numeradas extra por si las autoridades competente, en algún momento del traslado, deciden abrir el criotanque para su comprobación; en este caso, se volverá a sellar con las bridas de la nueva numeración y el incidente ha de quedar detallado por escrito.

La documentación para el centro receptor consta de la siguiente información: centro origen; fecha de congelación; tipo y características (semen, ovocitos, embriones); procedimiento detallado de criopreservación y recomendaciones para su descongelación; así como información relevante donantes/pacientes, origen de los gametos.

Transporte del material criopreservado. Es importante saber que el traslado, no pueden realizarlo los propios pacientes, ha de ser personal autorizado. Es necesario contar con una empresa de transporte certificada y autorizada para el traslado de muestras biológicas. Aunque en casos de una corta distancia, el personal de la clínica origen pueden realizarlo hasta el centro de destino (de ello doy fe).

El traslado, se recomienda principalmente por vía terrestre, por carretera, y en caso que sea forzoso por vía aérea, es importante el uso de aviones de gran tamaño, donde siempre el material biológico ha de ir en cabina junto a la persona responsable del traslado. Un estudio sobre el traslado aéreo de ovocitos vitrificados, aunque se realizó con un bajo número de casos, señalaba que existe una cierta inestabilidad de temperatura durante el trayecto, especialmente al despegar y aterrizar el avión, que coincide con cambios de presión, encontrando una cierta disminución en las tasas de implantación y gestación, si bien no era significativo, es un dato a valorar.

Una vez llegado el material criopreservado al centro receptor, tendrá que comprobar que todo está en orden y aceptar las muestras.
Todos los pasos han de estar perfectamente documentados para obtener una trazabilidad de todo el proceso. Fig 1.

Fig. Resumen de los pasos en el traslado de muestras criopreservadas a petición del paciente.

Un punto importante a conocer: Traspaso de custodia

Durante el proceso de traslados, nacional o internacional, se produce un traslado de custodia del material criopreservado, o, dicho de otra manera, un cambio de responsabilidad sobre ello.

El centro origen gestiona que las muestras solicitadas para el traslado estén debidamente etiquetadas y almacenadas en el contenedor de nitrógeno líquido, así como con la documentación pertinente. Una vez entregado al transportista, su responsabilidad termina.

La compañía transportista, desde el momento que firma la recepción, es responsable de las muestras. Si bien no suele ocurrir, puede que, a pesar de todas las medidas llevadas a cabo para un traslado óptimo, se produjese algún accidente que dañara las muestras. En ese caso, el responsable es la compañía trasportista, a la cual se le pedirá la responsabilidad civil.

En el centro de destino, lo primero es comprobar si el material está en perfectas condiciones. Caso de no ser así, ha de dejarse constancia por escrito del problema.

SI todo está bien, el centro receptor firma la aceptación de las muestras y la responsabilidad del material criopreservado entregado recae sobre el centro receptor.

Traslados

Ya sean Nacionales o Internacionales están sujetos al Real Decreto 65/2006, de 30 de enero, por el que se establecen los requisitos para la importación y exportación de muestras biológicas. y posterior modificación con la Orden SAS/3166/2009

Nacionales. Legislación vigente. Pasos descritos para traslado de muestars criopreservadas a petición de los pacientes.
Internacionales. Destacar que mientras el traslado es dentro de la UE rigen las misma normativa para traslados de petición de pacientes, como hemos visto, en nuestro país.

En países fuera de la UE, traslados extracomunitarios, requieren autorización Ministerio de Sanidad previo. Caso afirmativo, siguen las mismas normas descritas para petición de pacientes.

Destacar que los traslados extracomunitarios a países del Este, Estados Unidos de América y Canadá, suelen tener problemas para obtener permisos ya que se no se permiten su traslado para su empleo en gestación subrogada.

En resumen:

1.- Los pacientes pueden trasladar sus gametos/embriones, tanto en territorio nacional como internacional, siempre que lo deseen.

2.- Existe todo un marco legal donde se especifica cómo proceder al realizar un traslado de material criopreservado entre centros autorizados.

3.- Los diferentes pasos del proceso, etiquetado, almacenaje, contenedores de transporte, traslado vía aérea y/o terrestre, y recepción de las muestras en el centro destino está perfectamente detallado y documentado. Trazabilidad.

4.- Existe un traspaso de custodia durante el proceso de traslado.

Espero que haya sido de tu interés. Si tienes alguna duda o quieres plantear alguna cuestión déjala en comentarios o escríbeme a victoriainvitro@gmail.com

Victoria

Placa de selección espermática mediante el empleo de células de la granulosa de la propia paciente.

En esta ocasión, ya que hace unos días se ha celebrado día de la Ciencia y la Tecnología, hemos considerado el presentar un trabajo de investigación. Nos hemos fijado que en el último Congreso ASEBIR 2023, la comunicación científica del Dr. Jorge Ten y su equipo, recibió el Premio a la Innovación GENEA BIOMEDX. Se trata de un proyecto de investigación que ha destacado por su carácter innovador en el ámbito de la biología de la reproducción. Nos ha parecido de interés invitar al director del proyecto a compartirlo con nosotros en esta sección.

Os hago, como siempre, una breve presentación. El Dr. Jorge Ten es Doctor en Ciencias de la Biología por la Universidad de Valencia. Embriólogo clínico senior certificado por ESRHE. Director de la Unidad de Embriología del Instituto Bernabeu y Profesor Asociado de la Universidad de Alicante

Conozcamos en qué consiste su innovadora investigación y su posible aplicación clínica.

Placa de selección espermática mediante el empleo de células de la granulosa de la propia paciente

Desde hace más de 3 años, el equipo de Embriología del Instituto Bernabéu, dirigido por el Dr. Jorge Ten, desarrolla un dispositivo que permite seleccionar a los mejores espermatozoides con ayuda de las células de la granulosa de la propia paciente. Esos espermatozoides son los que se emplearán posteriormente en el proceso de fecundación in vitro.

¿Y por qué las células de la granulosa?

Para que suceda la fecundación en el tracto reproductor femenino deben ocurrir una serie de procesos moleculares coordinados entre el espermatozoide y el ovocito.

Uno de los procesos esenciales es el paso del espermatozoide a través de las células del cúmulo, las cuales están formadas por una gran cantidad de células de la granulosa que envuelven al ovocito. Estas células secretan diferentes sustancias que están involucradas en la selección espermática, como son la progesterona, prostaglandinas o el ácido hialurónico. Se ha descrito que la progesterona tiene la capacidad de atraer a los espermatozoides, estimular su movimiento flagelar y favorecer ciertas modificaciones y/o reacciones en el espermatozoide que le permiten adquirir la capacidad fecundante.

Por todo ello, pensamos que el uso de estas células para la selección espermática in vitro podía ser un método más natural y que además no estaba implantado en los laboratorios como un procedimiento de práctica clínica habitual.

Proyecto inicial de investigación y resultados esperanzadores

Comenzamos entonces una larga andadura, iniciada con un estudio piloto en el que analizamos el efecto de la selección espermática mediante células de la granulosa en 1000 ovocitos. Aquellos espermatozoides que atravesaban esta barrera celular tenían más posibilidades de fecundar y el desarrollo embrionario posterior era mejor, alcanzando más embriones el estadio de blastocisto y mejorando la calidad de los mismos.

Desarrollo industrial del dispositivo

Tras estos resultados prometedores, y con la ayuda de un equipo de ingenieros, diseñamos una placa de selección, donde estudiamos la capacidad de albergar un número suficiente de células de la granulosa y de espermatozoides.

Tras varios prototipos, la placa específica para la selección espermática fue elaborada según las buenas prácticas de fabricación y estaba compuesta por materiales embriotestados. La placa con nombre comercial “Oosafe® ICSI Dish with Sperm Selection” ha sido producida por la empresa SparMED (Denmark), fabricantes de materiales fungibles usados habitualmente en el laboratorio de reproducción asistida.

En dicha placa se realizan los dos procedimientos: la selección espermática y la microinyección intracitoplasmática (ICSI), con el objetivo de minimizar los riesgos y reducir el uso de material de laboratorio.

La placa se divide en dos secciones bien diferenciadas: una sección superior dedicada a llevar a cabo la ICSI, y una sección inferior que consta de carriles diseñados para la deposición tanto de las células de la granulosa como de los espermatozoides. Estos carriles están grabados en la placa y se componen de tres zonas claramente diferenciadas, cada una con un propósito específico. La Zona 1 (derecha) se utiliza para depositar los espermatozoides, la Zona 2 (central) se dedica al almacenamiento de las células de la granulosa, y finalmente, la Zona 3 (izquierda) es el destino de los espermatozoides que han atravesado las células de la granulosa y, por lo tanto, los que serán utilizados para la microinyección.

En estos momentos, continúa en marcha un estudio prospectivo aleatorio y multicéntrico para verificar los efectos beneficiosos del empleo de este dispositivo. Parte de estos resultados han sido enviados a la Sociedad Europea de Reproducción Humana y Embriología (ESHRE) y estamos a la espera de conocer si finalmente serán publicados.

En otra línea paralela, también observamos una disminución significativa de la fragmentación del ADN de los espermatozoides que fueron capaces de atravesar la barrera de células de la granulosa. Este trabajo fue aceptado como comunicación oral en el Congreso ASEBIR del pasado año y además obtuvo el Premio a la Innovación, otorgado por Genea Biomedx.

Felicitamos al Dr. Jorge Ten por su trabajo y agradecemos su colaboración y amabilidad al compartir con nosotros su proyecto.

Espero que haya sido de tu interés y si tiene alguna duda o curiosidad házmelo saber en comentarios o escríbeme a victoriainvitro.com

Victoria

¿Qué hacer con los cigotos monopronucleados?

La comprobación de la fecundación de los ovocitos, se realiza entre las 16h-18h tras haber realizado la inseminación por FIV o ICSI (D+1). Es importante analizar si los ovocitos tienen una fecundación normal, para ello han de presentar los 2 pronúcleos (PN) y los 2 corpúsculos polares (CP), sería representado por 2PN+2CP. Pero, pueden ocurrir una serie de alteraciones en los procesos, en la extrusión del segundo corpúsculo polar y/o formación de los pronúcleos dando lugar a fecundación anómala y, por tanto, en la mayoría de los casos, son descartados.

Origen de 1PN+2CP

En el caso que nos ocupa, en cigotos 1PN+2CP, la presencia de un solo pronúcleo (incidencia entre el 2,7% – 5,6%), en principio, podría indicar que es haploide (23 cromosomas) y por lo tanto no viable, ni transferible. Sin embargo, podría ser que el cigoto 1PN fuese diploide, debido a diferentes orígenes:

1. En el 80% de los casos la haploidía es debida a una forma de partenogénesis en la que el óvulo es activado por la presencia del espermatozoide (sin entrada del espermatozoide) o activación de ovocitos con entrada de espermatozoides, seguida de formación de pronúcleo femenino, sin que se forme pronúcleo masculino, por lo cual éste no contribuye con su ADN a la descendencia (ginogénesis). Mientras que es menos común la formación del pronúcleo masculino, el pronúcleo femenino no se forma (androgénesis)

2. La observación puntual puede no valorar una asincronía en la formación de los pronúcleos, es decir, que se formen los pronúcleo en tiempos diferentes, o se haya producido una fusión temprana (3-4h), donde la formación de pronúcleos femenino y masculino se fusionan/incorporan, creando un gran pronúcleo, por lo tanto, serían cigotos diploides (46 cromosomas)

3. Disomia uniparental es un hecho ocasional en el que un pronúcleo no se desarrolla, pero el otro pronúcleo ya contiene un genoma diploide o, alternativamente, el genoma haploide sufre una endoreduplicación.

Hasta hace unos años cigotos con fecundación anormal era descartados, pero posteriormente diversos trabajos publicados sostienen que los embriones derivados de cigotos 1PN han dado lugar al nacimiento de niños vivos sanos, por lo cual han propuesto que los embriones derivados de cigotos 1PN no deben ser descartados sino considerados para transferencia. Sin embargo, los derivados de ICSI, el cultivo a blastocistos no es tan eficaz, y por tanto, la transferencia de estos embriones 1PN debe tratarse con precaución.

Entonces… ¿Qué hacer los cigotos 1PN?

Según los criterios ASEBIR (2015), que se mantienen respecto a los cigotos 1PN en la actualización de 2018, morfología convencional, aquellos embriones derivados de cigotos 1PN fecundados mediante FIV, se aconseja dejarlos en cultivo extendido hasta blastocisto ya que en un 80% son blastocistos diploides. Mientras que, para aquellos cigotos 1PN derivados de ICSI se aconseja descartarlos, ya que sólo un 20% de ellos, si evolucionan, serían embriones euploides. No obstante, la decisión de seguir adelante con el cultivo de estos embriones queda bajo criterio de cada laboratorio. Tabla I

El estudio de la morfocinetica, con la aparición de los sistemas Time-lapse (STL) ha aportado mayor información gracias a la observación continua de los fenómenos de fecundación, desde la extrusión del segundo CP, aparición de PN masculino y PN femenino, fusión, y la desaparición pronuclear y posterior desarrollo embrionario. Estas observaciones permiten una mejor categorización del desarrollo pronuclear (pronúcleos de tamaño desigual, pronúcleos desplazados a la periferia de la célula o pronúcleos que no se unen a las 16-18 h o tienen un aparición más tardía) y su relación con un normal o menor desarrollo embrionario.

El tamaño del 1PN puede indicar que contenga los genomas masculino y femeninos, aquellos que presentan un área pronuclear grande (≥ 710 μm2) o un diámetro ≥ 31 μm, tienen un potencial de desarrollo similar al de los cigotos 2PN. No obstante, es necesario validar estos datos con más estudios.

Además, la monitorización time-lapse permite diferenciar entre el pronúcleo originado por espermatozoides y ovocitos por su proximidad al segundo cuerpo polar, con diferentes características morfocinéticas y morfométricas reportadas entre los dos pronúcleos. Un trabajo que me parece muy ilustrativo es el de Wei et al (2022) donde miden la distancia entre la posición de la extrusión del segundo cuerpo polar y el cono de fertilización o epicentro/posición inicial de la onda citoplasmática (mediante un software de análisis de vectores). Encuentran un alto grado de precisión en la formación de un cigoto 1PN, que se forma cuando la fusión del espermatozoide tiene lugar dentro de los 17 μm-18 μm desde el punto de extrusión del segundo cuerpo polar (dependiendo del sistema de observación time-lapse empleado). Sus observaciones indican:

Los cigotos 1PN diploides se forman cuando el espermatozoide se fusiona con la membrana del ovocito proximal a los cromosomas que se encuentran debajo del segundo cuerpo polar.

Una activación partenogenética femenina puede ser sospechada en cigotos 1PNs cuando no se observa la formación del cono de fertilización y ni la onda citoplasmática, debido a que el espermatozoide no ha entrado en el óvulo.

Una posible explicación de la formación de un cigoto 1PN anómalo cromosómicamente tras ICSI, puede tener su origen debido a fenómenos como la rotura de la membrana del citoplasma del ovocito, la aspiración del huso meiótico con la pipeta de inyección o cuando se inyecta un espermatozoide muy cerca del huso.

No obstante, la determinación de la ploidía del 1PN, a fecha de hoy, sólo es posible obtenerla mediante los estudios genéticos. El primero en alertar sobre el potencial de los cigotos 1PN fue Manor et al. (1966) aconsejando el análisis de estos embriones, a los que denominó “embriones indocumentados”, mediante la hibridación in situ fluorescente, FISH antes que ser descartados. Con los grandes avances en genética, hoy la biopsia de trofoectodermo seguida del Test Genético Preimplantacional para Aneuploidías (PGT-A) con secuenciación de última generación (NGS), combinado con el análisis de los polimorfismos de ADN, revelan si los embriones de 1PN son verdaderamente haploides, o si se ha producido una fecundación normal. Determinar los embriones derivados de 1PN euploide, permite contar con blastocistos euploides extra para los todos los casos en general y de un valor añadido en los casos de pobre pronóstico.

También se recomienda para confirmar que el feto es cromosómicamente normal, realizar pruebas prenatales no invasivas (NIPT) a las 9 a 10 semanas y por un diagnóstico prenatal como una muestra de vellosidades coriónicas (CVS) a las 11 a 12 semanas o una amniocentesis a las 15. –16 semanas.

Información a pacientes sobre los cigotos 1PN

Los resultados obtenidos en transferencia de embriones derivados de cigotos 1PN ponen de manifiesto que, aunque las tasas respecto a gestación y niño recién nacido frente a los embriones derivados de 2PN son más bajas, los embriones derivados de 1PN procedentes de FIV tienen tasas mayores de éxito que los de ICSI.

Si bien es cierto que no hay una evidencia fuerte sobre los embriones derivados de 1PN, debido a la gran variabilidad de criterios entre los diferentes centros, heterogeneidad a la hora de realizar los estudios y el desconocimiento de los resultados de niños nacidos. Por lo tanto, los pacientes deben recibir asesoramiento adecuado y tomar decisiones informadas sobre la seguridad de la transferencia de estos embriones, si prefieren descartarlos, realizar sólo un cultivo a blastocisto, en cuyo caso hay que valorar la posibilidad de una gestación molar, aunque hay publicados escasos casos, haploidia o disomia uniparental que podrían ser posibles.

Recientemente, en el I Simposio Hospital Ruber Madrid sobre Reproducción Asistida (7 y 8 de marzo de 2024), hemos tenido la oportunidad de conocer el trabajo de C. Ussher, embrióloga de Genea, Melbourne, (Australia) que ha tratado este tema y nos ha mostrado su experiencia con más de 18.802 ciclos. Dado que no todos los embriones derivados de cigotos 1PN son anormales, consideran su utilización en la rutina del laboratorio tras el empleo los test adecuados, PGT-A y herencia biparental. La posibilidad de obtener embriones euploides derivados de cigotos 1PN permite disponer de embriones extra especialmente en casos de pobre pronostico. El esfuerzo del laboratorio, análisis genéticos, información a pacientes etc. debe realizase manteniendo un delicado equilibrio entre el riesgo y la recompensa.

En resumen:

La propuesta de emplear cigotos 1PN en el rutina de laboratorio implica prudencia y una serie de planteamientos como son:

Realizar el cultivo extendido a blastocisto. Los cigotos 1PN tienen una tasa menor de desarrollo que los cigotos 2PN+2CP, en concreto los derivados de ICSI.
Necesario el análisis PGT-A y test biparental para determinar euploidia (2,7%)
Los embriones derivados de cigotos 1PN, son adicionales, no prioritarios para transferir. Aunque permiten aumentar el número de embriones para transferencia, tienen baja tasa de implantación y gestación.
Su implementación en el programa de reproducción exige más tiempo para informar a los pacientes, firmar un consentimiento informado específico y consensuar con ellos el modo de proceder.
En la rutina del laboratorio implica más cultivos extendidos a blastocistos a controlar, realizar las pruebas genéticas de PGT-A y de herencia biparental, así como la criopreservación los embriones euploides extra.
Son necesarios más estudios, estandarizados y con fiel reflejo de los resultados de los nacimientos de los niños nacidos de embriones derivados de cigotos 1PN.

Victoria